Методы лабораторной диагностики инфекций делят на прямые (определение антигенов или нуклеиновых кислот возбудителя) и непрямые (определение антител к возбудителю).
Основные методы, используемые для лабораторной диагностики вирусных инфекций, – это иммуноферментный анализ (ИФА), реакция иммунофлюоресценции (РИФ) и полимеразная цепная реакция (ПЦР).
Материалом для исследования являются биологические жидкости организма – чаще кровь, реже ликвор, слюна или буккальный соскоб, моча, слизь из зева или носа.
При ИФА определяют находящиеся в биологической жидкости суммарные антитела и/или антигены вируса путем связывания их со специфическими антигеном/антителом вируса, сорбированными на твердой фазе и меченными ферментом, с последующим расщеплением хромогена и регистрацией результата. Выявляются как суммарные антитела, так и антитела различных классов (IgM, IgG, IgA). Возможно установление титра антител к возбудителю.
Разновидность ИФА с определением антител к отдельным белкам вируса – иммуноблотинг (ИБ), служит подтверждающим (конфирматорным) тестом для скринингового обследования в ИФА.
При проведении РИФ определяют антигены возбудителя путем связывания их со специфическим антителом, меченным флюоресцентным агентом с последующей детекцией свечения под микроскопом.
Быстрые тесты (экспресс тесты) позволяют выявлять антитела и/или антигены вируса быстро (за 10-30 минут) и без использования специальной лабораторной техники. Они могут быть основаны на разных методах, например, латекс-агглютинации.
ПЦР подразумевает определение нуклеиновых кислот (РНК или ДНК) вируса в биологических жидкостях. Возможна полуколичественная оценка содержания возбудителя в материале и определение его генетических характеристик (генотипа, резистентности к химиопрепаратам).
Факторы, влияющие на результаты лабораторных анализов.
На результат лабораторного анализа влияют многие факторы, связанные как непосредственно с качеством лабораторной диагностики (диагностическая чувствительность и специфичность метода и используемых тест-систем), так и с правильным выбором метода лабораторной диагностики (исходя из представлений о биологии возбудителя и течения инфекции) и с правильными забором, хранением и транспортировкой материала в лабораторию.
Ошибки лабораторной диагностики
|
Ошибки |
Суть ошибки |
Причины ошибки |
| «Врачебные» | Неверно выбранная диагностическая стратегия обследования больного или неправильная интерпретация результатов диагностики | Неверные представления о биологии исследуемого инфекционного агента или о возможности метода диагностики |
| «Лабораторные» | Получение ложноположительного или ложноотрицательного результата | Нарушение правил забора, хранения и транспортировки проб, или ошибки при исследовании непосредственно в лаборатории |
Чувствительность – вероятность получения положительного результата теста у больных пациентов (истинно положительного результата). Рассчитывается как отношение количества людей с истинно положительной реакцией на этот тест при наличии у них какого-либо заболевания к общему числу больных этим заболеванием людей (имеющих и истинно положительные, и ложноотрицательные ответы).
Специфичность – вероятность получения отрицательного результата теста у здоровых пациентов (истинно отрицательного результата). Рассчитывается как отношение количества здоровых людей, у которых имеет место отрицательная реакция на тест к общему числу здоровых людей (имеющих и истинно отрицательные, и ложно положительные ответы).
Положительная предсказующая ценность – вероятность заболевания в процентах при положительном результате теста.
Отрицательная предсказующая ценность – вероятность отсутствия заболевания при отрицательном результате теста.
Интегральная оценка эффективности диагностики (диагностической чувствительности и специфичности) проводится по ROC-кривой (с вычислением AU ROC и 95% доверительных интервалов к ней).
Особое значение имеет осуществление правильного забора, хранения и транспортировки материала. Наиболее требовательным является культуральный метод – необходима быстрая доставка материала в лабораторию и обязательное сохранение жизнеспособности возбудителя. Для постановки ИФА, ПЦР возможно хранение замороженной плазмы крови. В фиксированном препарате можно проводить микроскопию, в т.ч. флюоресцентную (РИФ).
Ошибки на этапе забора, хранения и транспортировки материала
|
наименование ошибки |
причина ошибки |
следствие ошибки |
способы предотвращения |
| загрязнение пробы на стадии забора материала | использование при заборе пробы инструментария, пробирок, перчаток и других материалов, загрязненных посторонней НК | ложноположительный результат | использование одноразового инструментария и материалов; повышение образовательного уровня медперсонала |
| загрязнение пробы примесями, ингибирующими ПЦР | проба содержит примеси ингибиторов ПЦР (гемоглобин, гепарин и другие) | ложноотрицательный результат | использование одноразового инструментария и материалов; соблюдение правил забора материала |
| забор материала выполнен неадекватно | несоблюдение правил забора материала (например, вместо соскоба клеток собрана поверхностная слизь) | ложноотрицательный результат | соблюдение правил забора материала (например, использование специальных щеточек-зондов) |
| разрушение НК при транспортировке и хранении пробы | несоблюдение правил транспортировки и хранения проб | ложноотрицательный результат | соблюдение правил транспортировки и хранения проб |
Достоинства и недостатки различных методов.
Каждый из используемых методов лабораторной диагностики обладает определенными достоинствами и недостатками, и занимает свою нишу в диагностическом процессе. Зачастую для диагностики требуется комбинированное использование нескольких лабораторных методов.
|
|
ИФА |
РИФ |
ПЦР |
| Что определяет метод | антитела или антигены (непрямой) | антигены (прямой) | нуклеиновую кислоту (прямой) |
| Сложность проведения метода | сложный | сложный | сложный |
| Быстрота получения результата | относительно быстро | относительно быстро | относительно быстро |
| Чувствительность | высокая | удовлетворительная | очень высокая |
| Специфичность | удовлетворительная | низкая | очень высокая |
| Субъективность интерпретации | объективная | очень субъективная | объективная |